qPCR樣所有PCR方法 - 擴增核酸，但qPCR也實時監測過程。當qPCR工作時，科學家必須設計和驗證測定。這在該過程的各個方面造成各種挑戰。
“Promega（麥迪遜，威斯康星）研究和開發小組的**研究科學家Rod Pennington說：”在設計一個qPCR測定中心對選擇引物和探針序列以及報道染料，尤其是多重測定中的關鍵挑戰。“此外，寡核苷酸序列的選擇和與可用的實時qPCR儀器兼容的檢測化學物質可能是一種困難的平衡作用。”他補充說，“多重測定中希望檢測的目標越多，平衡作用越不穩定可。”
另外的挑戰進一步使設計階段復雜化。例如，Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA）遺傳分析的**產品經理Karen Li指出需要獲得**新的序列信息，避免“序列變異，包括SNP，插入，缺失和低復雜性序列“。有了這些信息，Li說，科學家然后需要確保”測定靶向獨特的序列，并且不會靶向基因組中的多個斑點。
靶標的特征影響PCR的工作程度。“在查看轉錄本時，**好在外顯子 - 外顯子連接處設計分析，以便不會檢測目標基因組DNA。”Li解釋說。“考慮是否需要檢測一個特定的轉錄本，或者如果你想檢測同一個基因的轉錄本變異。”她補充說，“對于轉基因實驗，確保你正在查看物種特異性靶點。
qPCR技術的一些進展使得更容易設計新的測定法。“具有多個檢測通道的qPCR儀器可以在一定程度上簡化測定設計，通過擴展設計寡核苷酸和探針的選項，”Pennington說。“在試劑方面，新的探針化學物質繼續被引入，并增加了測定設計的靈活性。
科學家也可以依靠現有的qPCR測定。如Li所說，“我們有廣泛和不斷增長的預先設計的TaqMan分析的選擇，其跨越一系列應用 - 基因表達，SNP檢測，拷貝數分析等，其使用廣泛的生物信息學分析設計，使用**新的序列信息來自公共數據庫，并對測定設計進行計算機質量控制以應對這些挑戰。
對于新的qPCR測定，請考慮使用設計工具。正如李先生指出的，“有許多測定設計工具可以幫助定制化驗設計。”她補充說，“我們的定制化驗設計工具--www.Thermofisher.com/ cadt-具有'定制加'管道選項將執行在我們預設計的測定法上進行的相同的生物信息學分析“。例如，該工具通常設計具有較小擴增子的分析，以在PCR反應中獲得更好的效率，并且為轉基因實驗和轉錄物特異性靶標提供選擇。
一旦科學家設計了一種測定，還有更多的工作要做，如優化它。“qPCR測定的成功取決于必須優化大量變量，例如組分濃度和熱循環參數，”Pennington解釋說。“qPCR測定的優化矩陣可能非常復雜，應包括代表性樣品材料的測試。
所需的優化級別取決于設計的質量。“良好的測定設計對于**大限度減少優化qPCR測定所需的工作**關重要，”Li說。“如果不注意在均勻的溫度下設計引物和探針，優化可能會有挑戰性。”如果設計不夠仔細，則需要更多的工作來盡可能高效地運行測定。As Li解釋說，“如果您不進行優化您的測定設計的前期工作，您將需要優化您的PCR反應，以找到**佳的退火/延伸溫度，不僅適用于您的引物和探針，你的主人混合和儀器。
在某些情況下，優化可能比在其他情況下更難。Pennington說：“如果樣品材料難以獲得，測定優化實驗材料的可用性可能會有問題。
為了在優化的**佳結果，科學家可能尋求qPCR技術的具體功能。“具有高通量潛力的儀器可以幫助優化，”Pennington說。“高通量潛力可能來自快速熱循環，容易與機器人移液站接口或其他功能。”同時運行多個熱循環曲線也可加快科學家優化測定的速度。
試劑也影響優化。“新的主混合產品相當頻繁地引入，并且在某些情況下允許從優化矩陣中去除某些參數，例如MgCl 2或酶濃度，”Pennington解釋說。“這可以減少實驗所需的實驗范圍。
在經過設計和優化qPCR測定的步驟后，需要對其進行驗證，以證明它真正做到了應該做的事情。BioNTech Diagnostics（德GMainz）分子診斷科學家Mark Laible說：“從我的角度來看，qPCR測定驗證中**具挑戰性的部分是由不同qPCR平臺引入的方差評估。“注意到您開發的測定儀器類型容易出現大的儀器間變化，這可能非常令人失望。
為了減少這種問題的可能性，他說，**好是“在技術開發早期選擇儀器間差異較小的儀器”。Laible說，要做這樣的選擇，應該**少“三種不同儀器的特定型號“。他補充說，”大多數儀器制造商都有助于讓您與其他實驗室接觸。
驗證所需的努力通常取決于手頭的應用。在許多情況下，市售的測定法將完成這項工作。然而，當需要時，可以開發用于特定應用的全新的qPCR測定。通過合適的qPCR和試劑，加上經驗和設計工具，科學家可以設計，優化和驗證測定。
